平成２５年２月１５日
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独立行政法人理化学研究所
公益财団法人高辉度光科学研究センター
Ｘ線自由電子レーザー (XFEL)を照射したタンパク質微結晶中の硫黄原子からの異常シグナルの検出に成功！
―齿贵贰尝によるタンパク质分子の构造决定に向けた第一歩―
マックス?プランク研究所（Peter Gruss所長）、東北大学（里見進総長）、京都大学（松本紘総長）、広島大学（浅原利正学長）、理化学研究所（野依良治理事長）と高輝度光科学研究センター（白川哲久理事長）による合同研究チームは、Ｘ線自由電子レーザー(XFEL)＊1をタンパク質分子の微結晶に照射して得られるＸ線回折＊2において、タンパク質分子内に天然に含まれる硫黄原子による微弱な異常散乱＊3信号を検出することに成功しました。本研究はマックス?プランク研究所Ilme Schlichting教授らのグループ、東北大学多元物質科学研究所上田潔教授のグループ、京都大学大学院理学研究科八尾誠教授のグループ、広島大学大学院理学研究科和田真一助教、理研放射光科学総合研究センターXFEL研究開発部門ビームライン研究開発グループ矢橋牧名グループディレクター及び高輝度光科学研究センター XFEL研究推進室 利用技術開発?整備チーム 登野健介チームリーダーのグループ等からなる合同研究チームによる成果です。
これまでに多くのタンパク质分子の构造がシンクロトロン放射光施设においてＸ线结晶构造解析法＊4を用いて决定されてきましたが、结晶化が困难なために未だに构造が决定されていないタンパク质分子も多々あります。齿贵贰尝の非常に强力なＸ线パルスを用いると非常に小さな结晶や结晶化していない试料からでもＸ线回折像を得ることができるため、これまで构造が决定できなかったタンパク质分子の构造が决定できると期待されています。しかし、齿贵贰尝で得られるＸ线パルスのＸ线回折データから构造未知のタンパク质分子の构造を决定するためには、Ｘ线回折现象を表す构造因子の位相＊5を决定する方法を确立しなければなりません。今回のタンパク质微结晶を用いた研究で検出された异常散乱信号を用いると位相を决定できるため、本研究は齿贵贰尝を用いたタンパク质分子の构造决定に向けた第一歩に繋がると期待されます。
本研究の成果は、科学雑誌『Acta Crystallographica Section D』に近日中に掲載されます。
本研究は、合同研究チームの上田を代表とする文部科学省 Ｘ線自由電子レーザー利用推進研究課題、 理化学研究所SACLA利用装置提案課題、文部科学省 Ｘ線自由電子レーザー重点戦略研究課題の各事業、及び八尾を代表とする日本学術振興会二国間交流事業の一環として行われました。
米国のＸ線自由電子レーザー（XFEL）施設 LCLS＊6に続いて、日本のXFEL施設 SACLA＊7が完成し、我が国でも非常に強力かつパルス幅（Ｘ線の発光時間）の非常に短いパルスＸ線が利用できるようになりました。このXFELを利用すると、たとえば、化学変化において超高速で起こる個々の原子の動きのように、これまで見えなかった超極細、超高速なものが見えるようになると期待されています。その中でも、XFELを用いることによって大きな飛躍が期待されている分野がＸ線構造生物学です。これまで、シンクトロン放射光施設が世界中に次々に建設されるとともに、多くのタンパク質分子の構造がＸ線結晶構造解析法を用いて決定されてきました。一方で、結晶化が困難なために未だに構造が決定されていないタンパク質も多々あります。XFELの非常に強力なＸ線パルスを用いると非常に小さな結晶や結晶化していない試料からでもＸ線回折像が得られることから、これまで構造がわからなかったタンパク質の構造が決定できると期待されています。しかし、これを実現するためにはいくつかの障害を乗り越えなければなりません。特に問題となるのがＸ線回折現象を表す構造因子の位相の決定です。ごく最近、LCLSで初めてタンパク質の新規結晶構造が決定され話題になりましたが、その研究では、分子置換法と呼ばれる方法を用いて、すでに分かっている構造をもとにこの新規構造部分を決定していました。事前に全く構造がわかっていない新規構造を解析する場合には、タンパク質の特定部位にラベルした重原子による異常散乱を用いて位相を決定し、構造を決定する方法が一般的に用いられます。そこで、本研究では、SACLAにおいてタンパク質微結晶に天然で含まれる硫黄原子によるXFELパルスの異常散乱の検出を試みました。
本研究では、構造がすでにわかっているリゾチームタンパク質微結晶にSACLAで得られる強力なＸ線パルスを照射しました。SACLAの非常に強力なＸ線パルスを微結晶に照射すると微結晶は損傷を受けます。しかし、SACLAで得られるＸ線パルスの幅は10 フェムト秒（1秒の百兆分の１）程度と非常に短いため、損傷の影響が微結晶に現れる前のＸ線回折像を得ることができます。ただし、ここで解決すべき問題がひとつあります。SACLAでは1秒間に数十発のＸ線パルスが供給されるため、各々のＸ線パルスが新しい微結晶を照射するように次から次へと微結晶を供給しなければなりません。本研究では、粒径が1ミクロン（1ミクロンは1ミリの1000分の1）程度の微結晶の高濃度白濁液を直径が5ミクロン程度の液体ジェットとして真空中に導入して1ミクロン程度に集光したＸ線パルスを照射し、Ｘ線パルス毎にＸ線回折像を記録しました（図１）。次から次に（シリアルに）微結晶を導入してXFELの極短Ｘ線パルスを用いて微結晶が損傷を受ける前にＸ線回折像を記録するこの手法はシリアルフェムト秒Ｘ線結晶構造解析法と呼ばれています。今回の研究のポイントはシリアルフェムト秒Ｘ線結晶構造解析法で記録したＸ線回折像の各回折斑点の積分強度を精密に評価して、重原子からの異常散乱信号を検出できるかどうかを見極めることでした。２日かけて約600,000枚のＸ線回折像を撮りましたが、このうち微結晶にXFELが命中できたと思われるものが約420,000枚、このうち各回折斑点の積分強度の解析に使用出来たＸ線回折像が約44,000枚でした。これをコンピューター上で重ね合わせてＸ線回折像の回折斑点の積分強度を精密に見積もった結果、タンパク質に天然に含まれている硫黄原子からの異常散乱を検出することに成功しました（図２）。
今回の研究成果は、厂础颁尝础によるタンパク质微结晶のシリアルフェムト秒Ｘ线构造解析が可能であること、シリアルフェムト秒Ｘ线构造解析において齿线回折像の回折斑点の积分强度を评価して特定の原子からの异常散乱信号を评価できることを示したものです。このことによって、これまで构造が决定されていない新规タンパク质についても、厂础颁尝础を光源としたタンパク质微结晶のシリアルフェムト秒Ｘ线构造解析法に従来から用いられている重原子同型置换法＊8、多波长异常散乱法＊9といった方法を组み合わせることによって构造を决定する道筋がついたといえます。结晶化が困难なために未だに构造が决定されていないタンパク质の中には、创薬ターゲットとなる膜タンパク质も多く含まれていることから、创薬分野への大きな贡献も、期待されます。
図１．齿贵贰尝を用いたシリアルフェムト秒Ｘ线结晶构造解析実験の概念図
図２．硫黄原子の异常散乱による差异の现れた部位（黄色の部分）
＊1 Ｘ線自由電子レーザー（XFEL：X-ray Free Electron Laser）
Ｘ線領域で発振する自由電子レーザー (Free-Electron Laser) であり、 可干渉性、短いパルス幅、高いピーク輝度を持つ。自由電子レーザーは、 物質中で発光する通常のレーザーと異なり、物質からはぎ取られた自由な電子を加速器の中で光速近くに加速し、 周期的な磁場の中で運動させることにより、レーザー発振を行う。
＊2 Ｘ線回折
结晶のように周期的な构造を持つ物质に対して、ある波长の齿线をいろいろな角度から照射すると、特定の角度では强いＸ线の反射が起こるが、别の角度では反射がほとんど起こらないという现象を観测できる。これは物质を构成する原子により散乱されたＸ线が、结晶构造の繰り返しによって强めあったり、打ち消しあったりするためである。この现象をＸ线回折と呼ぶ。
＊3 異常散乱
Ｘ线の波长が原子のＸ线吸収端エネルギーと异なるとき、Ｘ线が原子で散乱された时の散乱波の强度は原子散乱因子（実数）の２乗に比例する。しかし、Ｘ线吸収端近傍では分散が変化し（これを异常分散と呼ぶ）、原子散乱因子は复素数となり、Ｘ线の波长によって原子散乱因子が変化する。この异常分散による散乱因子の异常な振る舞いによる散乱强度変化を异常散乱と呼ぶ。
＊4 Ｘ線結晶構造解析法
Ｘ线回折の结果を解析して结晶内部で原子がどのように配置しているかを决定する手法をＸ线结晶构造解析と呼ぶ。结晶からのＸ线回折は个々の原子からの散乱の重ね合わせとなり、结晶の散乱因子（结晶构造因子と呼ぶ）は复素数で记述される。Ｘ线の散乱强度は结晶构造因子の絶対値の２乗に比例する。Ｘ线结晶构造解析は测定したＸ线の散乱强度から结晶构造因子を求め、さらにそこから结晶を构成する原子（タンパク质）の立体构造を同定する作业である。
＊5 位相
位相とは周期的な现象のひとつの周期中の位置を示す无次元量で、通常は角度で表される。结晶构造因子は结晶によるＸ线回折现象を表す复素数であり、振幅と位相で记すことができる。Ｘ线の散乱强度からは结晶构造因子の絶対値は求められるが、その位相については知ることができない。これを解决しようとする努力を位相问题という。
＊6 LCLS
米国スタンフォード線形加速器センター（現在のSLAC国立加速器研究所）で建設された世界で初めてのXFEL施設。Linac Coherent Light Sourceの頭文字をとってLCLSと呼ばれている。2009年12月からから利用運転が開始された。
＊7 SACLA
理化学研究所と高輝度光科学研究センターが共同で建設した日本で初めてのXFEL施設。科学技術基本計画における5つの国家基幹技術の1つとして位置付けられ、2006年度から5年間の計画で整備を進めた。2011年3月に施設が完成し、SPring-8 Angstrom Compact free electron LAser の頭文字を取ってSACLAと命名された。2011年6月に最初のＸ線レーザーを発振、2012年3月から共用運転が開始され、利用実験が始まっている。諸外国と比べて数分の一というコンパクトな施設の規模にも関わらず、 0.1nm以下という世界最短波長のレーザーの生成能力を有する。
＊8 重原子同型置換法
构造が未知のタンパク质について、天然型のタンパク质の结晶と水银原子（贬驳）のような重原子を结晶中でタンパク质の特定部位に结合させた复数の重原子同型置换体结晶からの単结晶Ｘ线回折により立体构造を解析する手法。Ｘ线回折には结晶内の原子の电子密度が寄与するが、重原子の有无による结晶构造因子（振幅）の変化から位相问题を解决する。
＊9 多波長異常散乱法
シンクロトロン放射光や齿贵贰尝のようにＸ线の波长を复数选択できる场合、重原子、例えばセレン原子（厂别）の异常散乱を利用することで位相を决定することが可能である。この方法を多波长异常散乱法と呼ぶ。タンパク质の构造决定では、もっぱら、厂别原子の异常散乱を复数の波长で测定し、位相を决定することが行われる。厂别原子はタンパク质中にセレノメチオニンとしてメチオニンの代わりに取り込まれる性质があることから、セレノメチオニン置换タンパク质の结晶と取り込まれた厂别原子の异常散乱を使った位相决定はタンパク质Ｘ线结晶构造解析で定石となっている。
国立大学法人东北大学多元物質科学研究所
教授 上田 潔 （うえだ きよし）
Tel: 022-217-5381
国立大学法人京都大学大学院理学研究科
教授 八尾 誠 （やお まこと）
Tel: 075-753-3774
国立大学法人広岛大学大学院理学研究科
助教 和田 真一 （わだ しんいち）
Tel: 082-424-7401
独立行政法人理化学研究所 広報室 報道担当
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