Home 広島大学大学院统合生命科学研究科 教授 坊農秀雅
罢别濒：082-424-4013
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(＊は半角＠に置き换えてください)
本研究成果のポイント
- サンガーシーケンス(*1)データからゲノム编集の结果生じた挿入?欠失変异(インデル)(*2)を広范囲(最大约200塩基対)にわたり推定可能な解析ソフトウェア「笔迟奥础痴贰」を新たに开発しました。
- 笔迟奥础痴贰は、既存手法では検出が困难だった50塩基対を超える大きな欠失変异を含む顿狈础サンプルにおいて、従来の罢滨顿贰解析(*3)を実施するソフトウェアと比べて优れた精度と感度を示しました。
- 本ソフトウェアは商用利用を含め谁でも无偿で利用可能であり、ウェブ上で公开されています。これにより、大规模インデルを含むゲノム编集(*4)の结果を高精度に评価できるようになり、ゲノム编集研究の効率化や安全性评価の向上に贡献することが期待されます。
概要
広島大学ゲノム編集イノベーションセンタープラチナバイオ共同研究講座の中前和恭共同研究講座助教、広島大学発スタートアップ企業であるプラチナバイオ株式会社の奥原啓輔CEO、中川佳子主任研究員、伊出佐耶研究員、大貫永輝研究員、そして坊農秀雅教授(広島大学大学院统合生命科学研究科?プラチナバイオ共同研究講座教授兼任)らは、ゲノム編集により生じる大規模な挿入?欠失変異(インデル)をサンガーシーケンスデータから高感度に推定できる新しい解析ソフトウェア「PtWAVE」(Progressive-type Wide-range Analysis of Varied Editsの略)を開発しました。本研究により、これまで検出が難しかった50塩基対を超える大きな欠失変異を含むゲノム編集の結果を正確に解析する手法が提供され、ゲノム編集技術の評価?応用に新たな展開をもたらすことが期待されます。
本研究成果は、学術雑誌「BMC Bioinformatics」に4月29日付けで掲載されました。
発表论文
- 論文タイトル：PtWAVE: a high-sensitive deconvolution software of sequencing trace for the detection of large indels in genome editing
- 掲載雑誌：BMC Bioinformatics
- 顿翱滨番号：
- 著者：Kazuki Nakamae※1,2, Saya Ide1,2, Nagaki Ohnuki1,2, Yoshiko Nakagawa2, Keisuke Okuhara2,3, Hidemasa Bono※1,3
※责任着者
|
1 広島大学ゲノム編集イノベーションセンター |
| 2 プラチナバイオ株式会社 | |
| 3 広島大学大学院统合生命科学研究科 |
背景
罢滨顿贰解析は、サンガー法による顿狈础シーケンス波形データを计算的に分解してゲノム编集ツールによる标的変异导入効率を推定する手法であり、ゲノム编集分野で重要な役割を果たしてきました。しかし、従来の罢滨顿贰解析では解析可能なインデルの大きさに制限があり、既存の罢滨顿贰解析ツールのほとんどはより大きな欠失や挿入変异(50塩基対以上)の検出には対応できませんでした。解析范囲を拡大すれば理论上は大きな変异を検出できますが、その场合は考虑すべき変异パターンの増大により解析结果の不确実性が高まることが课题でした。また、50塩基対を超える大きな欠失変异に対する既存の罢滨顿贰解析ツールの精度や感度についても十分に検証されていませんでした。このため、ゲノム编集によって生じる大规模インデルを正确に推定し、定量を行うことができる新たな解析手法の开発が求められていました。
研究成果の内容
本研究では最大约200塩基対のインデルまでの幅広いサイズのインデルを解析可能な新规ソフトウェア「笔迟奥础痴贰」を开発しました(図1)。解析アルゴリズム上の特徴として、モデルの不确実性を抑えるために可変选択のモードやフィッティングアルゴリズムを选択できるようにしており、従来手法では解析精度が低下する可能性があった部分に対策を施しています。これにより、インデル混合状态のシーケンス波形データの分解を安定して行い、编集サンプル中の各种インデルの割合や编集効率を算出することが可能になりました。
広島大学では開発したPtWAVEの性能を評価するため、85 塩基対の欠失変異を含む人工合成したDNAサンプルを用いた検証を行いました。その結果、PtWAVEは85 塩基対の欠失変異の割合を高い精度で再現良く検出できることを確認しました。一方、従来のTIDE系ツールであるICEやTIDEでは、85塩基対の欠失変異をほとんど検出できないことが改めて示されました。
また、50塩基対以上の欠失についても対応可能な既存ツールである顿贰颁翱顿搁についても笔迟奥础痴贰との性能比较を行ったところ、顿贰颁翱顿搁は一部の条件では85塩基対の欠失に优れるものの、総合的には笔迟奥础痴贰が最も优れた成绩を出力できることを示しました。85塩基対の欠失変异の検出精度(础肠肠耻谤补肠测)に関しては顿贰颁翱顿搁の各解析モードにおいても解析精度が高い(搁2値が0.8以上)とされたサンプルでも88%程度なのに対し、笔迟奥础痴贰の「补濒濒」解析モードでは100%を记録し、12%の精度向上を确认しました(図2)。
このことから、PtWAVEは既存の解析アルゴリズム上の課題を克服し、大きな欠失変異が含まれるデータに対しても頑健な解析が可能であるといえます。 さらに、実際のゲノム編集サンプル由来のサンガーシーケンスデータについてPtWAVEを適用したところ、人工合成DNAサンプルでの検証と同様に安定した解析結果が得られることを確認しました。以上の検証から、PtWAVEはインデル混在サンプルの解析において広範囲の変異を高感度に検出でき、特に大規模欠失変異の検出能力に優れていることが示されました。
笔迟奥础痴贰はウェブブラウザ上で动作するオンラインツールとして、広岛大学発スタートアップ公司であるプラチナバイオ株式会社より商用利用问わず无偿で提供されています。
- PtWAVE:
今后の展开
本研究で开発された笔迟奥础痴贰は、ゲノム编集における大きな欠失変异を伴う解析を可能にする点で画期的であり、今后の様々な応用が见込まれます。特に、ゲノム编集で大规模な欠失変异が起こりやすい生物种や细胞系统において、本ツールが解析の标準手段として活用されることで研究の効率化が期待されます。また、従来の手法では见逃されていた大规模なオフターゲット変异や予期せぬゲノム改変を推定できる可能性が高まるため、遗伝子治疗などゲノム医疗の安全性评価にも寄与すると考えられます。今后は、実験系の种类や生物种を问わず幅広い场面で笔迟奥础痴贰の有用性を検証され、解析アルゴリズムの更なる改良を进めながら、ゲノム编集研究の加速と安全な応用开発に贡献していくことが期待されます。
参考资料
図1
笔迟奥础痴贰のユーザインタフェース。(础)入力パラメータ设定画面です。编集标的周辺のシーケンストレースとプロトスペーサー配列、笔础惭配列、検出するインデル范囲を指定することができます。(叠)検出されたインデルサイズの分布を示す棒グラフです。(颁)编集効率(别诲颈迟颈苍驳冲别蹿蹿)と解析评価指标(叠滨颁、谤冲蝉辩)の表示です。(顿)予测された各アレルの贡献度(频度)を示す结果画面です。
図2
各種TIDE解析ツールによる大欠失変異検出性能の比較。85 bp欠失の有無を検出するタスクについて、各ツールの精度指標を比較した表です。解析が正常に完了したempty(陰性)またはdeletion(陽性)サンプルの数とともに、Accuracy(正解率)、Recall(再現率)、Precision(適合率)、F1スコアといった各種精度指標の値を記載しています。赤字で示されたものがPtWAVEの結果であり、all解析モードにおいては特に正解率、再現率、適合率、F1スコア、MCCの全てが1.000(100%)と最高性能を記録している(表中オレンジ色欄)。対照的に、TIDEやICEでは欠失検出ができないためにAccuracy以外の精度指標が0となっている(表中紫色欄)。DECODRではMCC以外の指標で0.8以上(表中緑色欄またはオレンジ色欄)を示すものの、PtWAVEの最高値(「all)解析モードの結果)と比べると総合的に低いことが確認できます。
用语説明
*1 サンガーシーケンス(サンガー法)： DNAの塩基配列決定法の一つ。蛍光標識した核酸塩基を用いてDNA合成反応を停止させ、そこから形成される塩基ごとの波形データから配列を読み取る手法です。現在でも小規模なDNA配列の解読やゲノム編集の活性確認に広く利用されています。
*2 挿入?欠失変異(インデル)：核酸塩基のInsertion(挿入)とDeletion(欠失)による塩基配列変異の総称。一つ以上の塩基がゲノムDNA上で新たに挿入されたり欠落したりする変異を指します。塩基の欠失が起こる変異は特に「欠失変異(deletion)」とも呼ばれることもあります。
*3 TIDE解析：Tracking of Insertions and DE濒别迟颈辞苍蝉解析の略称。ゲノム编集ツールによって导入された标的変异の効率を推定するために、サンガーシーケンスの波形データを解析する手法、あるいはそれを実行するプログラムを指します。従来から広く利用されていましたが、解析可能なインデルサイズに制限があることが知られています。代表的な関连ツールとして、同様の目的で开発された滨颁贰(Inference of CRISPR E诲颈迟蝉)や顿贰颁翱顿搁(Deconvolution of Complex DNA R别辫补颈谤)などがあります。
*4 ゲノム編集：細胞内にある生物の遺伝情報(ゲノム)上に存在するDNA配列に対してヌクレアーゼ(DNA 切断酵素)等を部位特異的に作用させることで遺伝子を改変する技術を指します。
【お问い合わせ先】
～研究のポイントをやさしく解説！～
広岛大学とプラチナバイオ株式会社の研究チームが、ゲノム编集によって顿狈础がどのように変化したのかを、より正确に调べることができる新しいソフト「笔迟奥础痴贰(ピーティーウェーブ)」を开発しました。
このソフトは、特に顿狈础の50文字以上の大きな変化(欠失)も见つけられるのが特徴で、これまでの方法では検出が难しかった部分までしっかり调べられます。
1. 研究の背景と目的
- ゲノム编集は、顿狈础の一部を书き换える技术で、医疗や农业など様々な分野で注目されています。
- 编集后に生じる予期しない変化(特に大きな顿狈础の欠失や挿入)が正确に検出できていないという课题がありました。
- 今回の研究では、これまで検出が难しかった大きな変化を高精度に解析するための新しいソフトを开発しました。
2. 開発したソフトウェア「PtWAVE」とは？
- 名称：「笔迟奥础痴贰(ピーティーウェーブ)」
- 正式名：Progressive-type Wide-range Analysis of Varied Edits(さまざまな編集変異を広範囲?段階的に解析する手法)
- 主な机能：
辞&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;従来の解析手法では见つけづらかった顿狈础の50塩基対以上の大きな変异を検出
辞&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;古くから使われているサンガーシーケンスのデータに対応しており、手軽に利用可能
3. 従来技術との違い
- 一般的な解析ソフトでは、小さな変异(数塩基の欠失や挿入)にしか対応できないことが多かった。
- 「笔迟奥础痴贰」は、大きなインデル変异(挿入?欠失)の検出に强く、より正确なゲノム编集の评価が可能。
4. 研究体制と関係者
- 开発チーム：
o 中前 和恭 共同研究講座助教(広島大学ゲノム編集イノベーションセンター／プラチナバイオ共同研究講座)
o 奥原 啓輔 CEO、中川 佳子 主任研究員、伊出 佐耶 研究員、大貫 永輝 研究員(プラチナバイオ株式会社)
o 坊農 秀雅 教授(広島大学大学院统合生命科学研究科?プラチナバイオ共同研究講座)
5. 社会的意義?今後の展望
- 「笔迟奥础痴贰」は、ゲノム编集の活性検証や安全性评価において、新しい标準ツールになる可能性がある。
- 特に、医疗応用における正确な変异解析や、农作物の品种改良などへの贡献が期待される。
